Separacja peptydów w chromatografii cieczowej

Rozdział peptydów stanowi jedno z największych wyzwań we współczesnej chromatografii cieczowej (HPLC/UHPLC), szczególnie w kontekście mapowania białek, analizy farmaceutycznej oraz badań proteomicznych. Sukces separacji zależy od trzech kluczowych czynników: wydajności kinetycznej kolumny, selektywności fazy stacjonarnej oraz pełnego odzysku analitu z powierzchni złoża.

W analizie peptydów kluczowe znaczenie ma szybkość transportu masy. Kolumny HALO®, oparte na technologii cząstek powierzchniowo porowatych (Superficially Porous Particles – SPP), rewolucjonizują ten obszar. Dzięki litej rdzeniowej strukturze i cienkiej warstwie porowatej, droga dyfuzji analitów jest znacznie skrócona, co minimalizuje rozmycie pasm.

Dla peptydów optymalnym wyborem jest porowatość 160 Å. Faza HALO® Peptide 160 Å (dostępna w wariantach uziarnienia 2 μm, 2.7 μm oraz 5 μm) zapewnia:

• Wysoką rozdzielczość przy ciśnieniach znacznie niższych niż w przypadku kolumn w pełni porowatych typu sub-2 μm.

• Doskonałą stabilność termiczną, co pozwala na pracę w temperaturach rzędu 60–90°C, niezbędnych do poprawy kształtu pików i skrócenia czasu retencji trudnych peptydów.

Nowością w ofercie dostępnej przez Genore są kolumny HALO® PCS (Positive Charged Surface). Peptydy często posiadają liczne centra zasadowe, co w standardowych układach z kwasem mrówkowym (FA) prowadzi do tzw. „tailingu” (ogonowania) pików. Faza PCS posiada niewielki ładunek dodatni na powierzchni, który elektrostatycznie odpycha kationy peptydowe, wymuszając ich ostrzejszą elucję. Jest to rozwiązanie idealne dla systemów LC-MS, gdzie unika się stosowania kwasu trifluorooctowego (TFA) ze względu na tłumienie sygnału.

W przypadku większych peptydów i białek, problemem bywa nieodwracalna adsorpcja na złożu. Japońska marka COSMOSIL (Nacalai Tesque) oferuje specjalistyczną kolumnę Protein-R.

Kluczowe cechy COSMOSIL Protein-R:

• Pory o wielkości 300 Å: Zapewniają swobodną dyfuzję większych łańcuchów polipeptydowych.

• Unikalna modyfikacja polimeryczna C18: Gwarantuje znacznie wyższy odzysk analitów w porównaniu do klasycznych faz monomerowych.

• Stabilność w niskim pH: Pozwala na długotrwałą pracę z fazami ruchomymi zawierającymi 0,1% TFA lub FA bez ryzyka degradacji fazy stacjonarnej.

Dobór odpowiedniej porowatości złoża (pore size) jest krytyczny dla zachowania kształtu piku i rozdzielczości:

• Peptydy małe i średnie (< 15-20 kDa): Najlepsze wyniki dają kolumny o porach 160 Å (np. HALO 160 Å Peptide). Zapewniają one większą powierzchnię właściwą, co przekłada się na lepszą pojemność rozdzielczą.

• Duże peptydy i małe białka (20 - 50 kDa): Tutaj standardem stają się pory 300 Å (np. COSMOSIL Protein-R).

• Bardzo duże białka i kompleksy (> 50 kDa): Należy rozważyć ultra-szerokoporowate złoża 400 Å lub nawet 1000 Å z linii HALO BioClass, aby uniknąć efektu wykluczenia cząsteczek z wnętrza porów.

Współczesna chromatografia peptydów odchodzi od uniwersalnych rozwiązań na rzecz kolumn dedykowanych. Wybierz szybkości technologii Fused-Core (HALO®) lub kolumnę optymalizowaną pod kątem odzysku (COSMOSIL®) pozwala na drastyczne skrócenie czasu analizy przy jednoczesnej poprawie czułości detekcji.

Więcej informacji technicznych oraz wsparcie w doborze odpowiedniej fazy stacjonarnej można znaleźć na stronach producentów oraz u polskiego dystrybutora tych technologii – firmy Genore chromatografia, specjalizującej się w zaawansowanych rozwiązaniach dla chromatografii cieczowej i gazowej oraz wyposażeniu laboratoriów.

Napisz do firmy Genore chromatografia

Zapisz się na nasz newsletter, co umożliwi nam informowanie o pojawiających się promocjach i nowościach w naszej ofercie.
Zapraszamy również do składania indywidualnych zapytań ofertowych.