Derywatyzacja przedkolumnowa - dlaczego sprawia problemy i co można z tym zrobić

Wykorzystanie standardowego HPLC w analizie aminokwasów wymaga przeprowadzenia ich w pochodne. Osiąga się to stosując derywatyzację przedkolumnową.

Analiza aminokwasów techniką HPLC z derywatyzacją przedkolumnową jest jedną z wymagających procedur w laboratorium chromatograficznym. Choć pozwala na uzyskanie bardzo niskich granic wykrywalności i świetną czułość, wiąże się z szeregiem specyficznych wyzwań.

Oto najczęstsze problemy, z jakimi borykają się analitycy:

Najpoważniejszy problem techniczny. Wiele odczynników derywatyzacyjnych tworzy związki, które ulegają degradacji w czasie.

• Przykład: Pochodne OPA (orto-ftalaldehyd) są stabilne tylko przez kilka-kilkanaście minut. Jeśli próbki czekają w autosamplerze w kolejce, wyniki dla pierwszej i ostatniej próbki w serii mogą się drastycznie różnić.

• Rozwiązanie: Konieczna jest automatyzacja procesu derywatyzacji bezpośrednio przed nastrzykiem.

Nie wszystkie odczynniki reagują ze wszystkimi aminokwasami.

• Przykład: Popularny odczynnik OPA reaguje tylko z aminami pierwszorzędowymi. Aminokwasy drugorzędowe, takie jak prolina czy hydroksyprolina, nie ulegają derywatyzacji. W związku z tym nie dochodzi do ich  rozdziału chromatograficznego oraz późniejszej detekcji.

• Rozwiązanie: Stosowanie alternatywnych odczynników (np. FMOC-Cl) lub derywatyzacji dwustopniowej, co jednak komplikuje metodę i wydłuża czas analizy.

Aby reakcja zaszła całkowicie, odczynnik derywatyzujący musi być dodany w dużym nadmiarze.

• Problem: Nadmiar odczynnika lub produkty jego hydrolizy mogą być wymywane z kolumny w tym samym czasie co badane aminokwasy, maskując sygnały analityczne.

• Rozwiązanie: Dobór odpowiedniej kolumny o wysokiej selektywności, modyfikacje metody rozdziału chromatograficznego

Reakcje derywatyzacji są niezwykle czułe na środowisko chemiczne próbki.

• Przykład: Zbyt wysoka siła jonowa próbki lub obecność substancji buforujących może zmienić pH reakcji, co drastycznie obniża jej wydajność. Konieczne są procesy odsalania próbek. Aminokwasy w próbkach biologicznych (np. osoczu) wymagają wcześniejszego całkowitego odbiałczenia, gdyż białka będą konkurować o odczynnik derywatyzujący.

Derywatyzacja manualna jest obarczona błędem. Nawet kilkusekundowa różnica w czasie dodawania odczynnika lub błąd w pipetowaniu mikrolitrowych objętości powoduje wysokie wartości RSD (relatywne odchylenie standardowe). 

Podsumowanie: optymalna rozdzielczość w chromatografii?

Z podanych powyżej powodów, badania aminokwasów prowadzi się przy zastosowaniu dedykowanych analizatorów. Automatyczny analizator aminokwasów jest rodzajem chromatografu, zaprojektowanym do automatycznych rozdziałów aminokwasów oraz prowadzenia derywatyzacji postkolumnowej - przepływowo - w trakcie analizy. W takim systemie odczynnik derywatyzacyjny jest precyzyjnie dodawany do aminokwasów rozdzielonych na kolumnie. Dzięki zastosowaniu techniki derywatyzacji postkolumnowej analityk może liczyć na wyniki wysokiej jakości, o wybitnej powtarzalności jakościowej i ilościowej. Przygotowanie odbiałczonej próbki do analizy wolnych aminokwasów polega na rozpuszczeniu ich w buforze do próbek, przefiltrowaniu przez filtr strzykawkowy bezpośrednio do fiolek i umieszczenie w tacy autosamplera analizatora aminokwasów. 

Więcej o automatycznym analizatorze aminokwasów można przeczytać na dedykowanej stronie:

Automatyczny analizator aminokwasów

Copyright Genore chromatografia © 2026