Derywatyzacja przedkolumnowa - dlaczego sprawia problemy i co można z tym zrobić
Analizy aminokwasów przy użyciu chromatografu HPLC
Wykorzystanie standardowego HPLC w analizie aminokwasów wymaga przeprowadzenia ich w pochodne. Osiąga się to stosując derywatyzację przedkolumnową.
Analiza aminokwasów techniką HPLC z derywatyzacją przedkolumnową jest jedną z wymagających procedur w laboratorium chromatograficznym. Choć pozwala na uzyskanie bardzo niskich granic wykrywalności i świetną czułość, wiąże się z szeregiem specyficznych wyzwań.
Oto najczęstsze problemy, z jakimi borykają się analitycy:
Niestabilność powstałych pochodnych
Najpoważniejszy problem techniczny. Wiele odczynników derywatyzacyjnych tworzy związki, które ulegają degradacji w czasie.
Przykład: Pochodne OPA (orto-ftalaldehyd) są stabilne tylko przez kilka-kilkanaście minut. Jeśli próbki czekają w autosamplerze w kolejce, wyniki dla pierwszej i ostatniej próbki w serii mogą się drastycznie różnić.
Rozwiązanie: Konieczna jest automatyzacja procesu derywatyzacji bezpośrednio przed nastrzykiem.
Problemy z aminokwasami drugorzędowymi
Nie wszystkie odczynniki reagują ze wszystkimi aminokwasami.
Przykład: Popularny odczynnik OPA reaguje tylko z aminami pierwszorzędowymi. Aminokwasy drugorzędowe, takie jak prolina czy hydroksyprolina, nie ulegają derywatyzacji. W związku z tym nie dochodzi do ich rozdziału chromatograficznego oraz późniejszej detekcji.
Rozwiązanie: Stosowanie alternatywnych odczynników (np. FMOC-Cl) lub derywatyzacji dwustopniowej, co jednak komplikuje metodę i wydłuża czas analizy.
Interferencje od nadmiaru odczynnika (Piki "duchy" - ghost peaks)
Aby reakcja zaszła całkowicie, odczynnik derywatyzujący musi być dodany w dużym nadmiarze.
Problem: Nadmiar odczynnika lub produkty jego hydrolizy mogą być wymywane z kolumny w tym samym czasie co badane aminokwasy, maskując sygnały analityczne.
Rozwiązanie: Dobór odpowiedniej kolumny o wysokiej selektywności, modyfikacje metody rozdziału chromatograficznego
Wpływ matrycy i pH
Reakcje derywatyzacji są niezwykle czułe na środowisko chemiczne próbki.
Przykład: Zbyt wysoka siła jonowa próbki lub obecność substancji buforujących może zmienić pH reakcji, co drastycznie obniża jej wydajność. Konieczne są procesy odsalania próbek. Aminokwasy w próbkach biologicznych (np. osoczu) wymagają wcześniejszego całkowitego odbiałczenia, gdyż białka będą konkurować o odczynnik derywatyzujący.
Precyzja i powtarzalność (Błąd ludzki) - największy problem derywatyzacji przeprowadzanej ręcznie
Derywatyzacja manualna jest obarczona błędem. Nawet kilkusekundowa różnica w czasie dodawania odczynnika lub błąd w pipetowaniu mikrolitrowych objętości powoduje wysokie wartości RSD (relatywne odchylenie standardowe).
Podsumowanie: optymalna rozdzielczość w chromatografii?
Z podanych powyżej powodów, badania aminokwasów prowadzi się przy zastosowaniu dedykowanych analizatorów. Automatyczny analizator aminokwasów jest rodzajem chromatografu, zaprojektowanym do automatycznych rozdziałów aminokwasów oraz prowadzenia derywatyzacji postkolumnowej - przepływowo - w trakcie analizy. W takim systemie odczynnik derywatyzacyjny jest precyzyjnie dodawany do aminokwasów rozdzielonych na kolumnie. Dzięki zastosowaniu techniki derywatyzacji postkolumnowej analityk może liczyć na wyniki wysokiej jakości, o wybitnej powtarzalności jakościowej i ilościowej. Przygotowanie odbiałczonej próbki do analizy wolnych aminokwasów polega na rozpuszczeniu ich w buforze do próbek, przefiltrowaniu przez filtr strzykawkowy bezpośrednio do fiolek i umieszczenie w tacy autosamplera analizatora aminokwasów.
Więcej o automatycznym analizatorze aminokwasów można przeczytać na dedykowanej stronie:
Automatyczny analizator aminokwasów
Copyright Genore chromatografia © 2026